前言简介
白介素1一类非常重要的具备生物活性单核细胞衍生蛋白,它参与了多种炎症与免疫反应. 有2种不同的白介素1已经被鉴别,分别为白介素1α和白介素1β,它们有相似的分子量,生物功能和相同的受体.白介素1蛋白是由巨噬细胞,单核细胞和各种类型的细胞(如成熟T细胞,纤维母细胞,上皮或内皮细胞,中性粒细胞和星形胶质细胞)分泌的.它们的生物学特性包括发热性,骨吸收,暴露抗原和刺激B和T淋巴细胞增殖.
原理
此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与大鼠白介素1β的量成正比.
 
检测范围
11.72 ~ 750 pg/mL
 
预期用途
 
■此IBL试剂盒能用于大鼠血清,EDTA血浆,细胞上清中白介素1β的定量检测
 
 
试剂盒成分
1  包被板:     抗大鼠白介素1β兔子IgG,亲合纯化                96T
2  酶标记抗体:
   (30倍浓缩)HRP标记抗大鼠白介素1β兔子IgG,亲合纯化         0.4mL x 1
3  标准品:           重组大鼠白介素1β                      0.5mL x 2     
4  EIA缓冲液:         含1% BSA, 0.05%吐温20  BPS                       30mL x 1
5  标记抗体稀释液:       含1% BSA, 0.05%吐温20  BPS                  12mL x 1
6  显色剂:                                 TMB底物液                                                15mL x 1
7  终止液:                                     1N硫酸                                                   12mL x 1
8  浓缩洗涤液:
 (40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20  BPS                      50mL x 1
 
 
操作说明
1实验所需器材(但试剂盒没有提供)
  酶标仪(450nm)          微移液管及其吸嘴
  量筒及烧杯             蒸馏水
  冰箱(4°C)               坐标纸(log/log)
  吸水纸                 试管(用于标准品稀释)
  温育箱(37°C ± 1°C)
  洗瓶(用于洗板)
  一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)
2准备

1. 洗涤液的准备

试剂盒的洗涤液是一种40倍浓缩液,用1950 mL蒸馏水稀释50 mL的浓缩洗涤液,制成2000mL即用稀释洗涤液. 置于冰箱内可保存2周.

1. 酶标记抗体的准备

试剂盒中的标记抗体是一种30倍浓缩物,根据所需量,用标记抗体稀释液稀释30倍.
示例:
如果你用一条板(8孔),就需800  μL.的标记抗体.就用870  μL的标记抗体稀释液稀释30  μL抗体浓缩液,充分混匀.并每孔各加100 μL
浓缩酶标记抗体需稀释后才能用于实验
剩余的稀释标记抗体液需密封瓶装,存于4°C

1. 标准品的准备

加0.5 mL的蒸馏水到瓶装标准品,制成浓度为1500 pg/mL大鼠白介素1β标准品液

1. 标准品的稀释

准备8支试管,并每支各加230 μL  EIA缓冲液.稀释成如下浓度,步骤如下图所示:
试管1                            750 pg/mL
试管2                            375 pg/mL
试管3                                             187.5 pg/ mL
试管4                                             93.75 pg/mL
试管5                                             46.88 pg/mL
试管6                                             23.44 pg/mL
试管7                                              11.72pg/mL
试管8                                   0 pg/mL(样品空白对照)
吸取230ul的标准品液于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀，如下图所示,按此规律稀释，第8号管为0 pg/mL作为样品空白对照

 

1. 样品稀释

 样品如需稀释时,必须用EIA缓冲液进行稀释
 如果样品中大鼠白介素1β的浓度范围一无所知的话,预先准备几个不同稀释浓度的样品液来确定最佳的检测浓度.
 
 
 
3实验步骤
使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无改变，标准曲线和样品检测必须同时进行.
 

试剂	待检测样品	标准品	样品空白	试剂空白
	检测样品100ul	稀释标准品（1-7管）100ul	EIA缓冲液（第8管）100ul	EIA缓冲液100ul
盖板，于4°C下温育过夜
洗板7次
酶标抗体	100ul	100ul	100ul	-
盖板，于4°C下温育30min
洗板9次
显色剂	100ul	100ul	100ul	100ul
室温避光温育30min
终止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加终止液后,30min内于450nm处读取OD值

1）设试剂空白对照，并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液
2）  确定好样品空白对照孔，检测样品孔和标准品孔，分别将100ul样品对照品(8号管)、检测样品和稀释好的标准品(1-7号管)加入到相应的微孔中。
3）盖板，4°C下温育过夜
4）用洗涤瓶剧烈洗板,再加入稀释洗涤液,静置15-30秒,再彻底倒去孔内反应液
重复洗板7次.
最后在吸水纸上拍干,去除残留液滴
如用自动洗板机洗板,先自动洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5）除试剂空白对照孔外,其余每孔各加100ul酶标抗体
6）盖板，4°C下温育30min
7）按照上述步骤4）洗板9次
8）  用一次性试管取所需量的显色剂，各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染，勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中
9）室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10）每孔各加100ul终止液，溶液颜色会变成黄色
11）擦去微孔板底部的污迹或水滴，确保微孔内溶液无气泡产生.加入终止液后30min内于酶标仪450nm处读取结果
 
 
特别注意

1. 收集样品后尽快检测. 如需保存, 冻存样品,但要避免反复冻融.检测前,将样品解冻至室温.
2. 如样品需稀释,用EIA缓冲液稀释
3. 建议样品,标准品做双份检测
4. 保持样品处于中性PH范围.有机溶剂的污染会影响实验结果
5. 只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板.不充足的洗板会导致错误的结果
6. 在吸水纸上拍干去除残留液滴时,切勿用吸水纸刮擦孔内壁
7. 显示剂应避光保存并避免与金属物质接触
8. 加终止液后,30 min内就应读取实验结果

 
结果计算
所有实验数据(包括标准品,检测样品的OD值),都应减去样品空白对照的OD值.
在log-log坐标纸用,以较正的OD值为纵坐标,相对应的浓度为横坐标,建立标准曲线. 样品直接在标准曲线上获取浓度值.
标准曲线示范

 
上图所示典型标准曲线仅用于演示示范,不能用于试验数据的获取.每次实验都应建立其标准曲线.
 
常规事项
1所有试剂置于2 - 8°C保存.实验前将试剂平衡至室温(约30分钟)
2瓶装标准品是冻干品,故小心打开瓶盖
3终止液是强酸物质.使用时,避免其接触皮肤和衣肤.
4弃置用过的物质前,用水冲洗
5 浓缩酶标抗体,EIA缓冲液和浓缩洗涤液可能会出现沉淀,但这并不会影响实验
6使用试剂后应洗手
7切勿混用不同批号的试剂
8别使用过期的试剂
9试剂盒仅供研究用,不能用于临床诊断.
存储与有效期
存储条件:2 - 8°C
有效期见试剂盒外包装